慢性心力衰竭时,心肌细胞内的钙瞬变发生异常,与正常的心肌相比,其[Ca2+]i 上升速度较慢,辐度较低,且恢复延迟;于是心肌的收缩速度减慢、强度降低和舒张迟缓,出现心功能受损.Ca2+的运动是调控心肌舒缩功能的中心环节.而这种钙瞬变的异常是由心衰时心肌细胞内各种钙调控蛋白的改变导致的.当心肌细胞受生物电的刺激发生兴奋时,胞膜除极,激活L 型钙通道开放,细胞外钙离子顺着浓度梯度进入胞内,触发钙依赖性钙释放,大量钙离子经Ryanodine Receptor (RyR)蛋白由内质网迅速进入胞浆,细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)急剧升高,并与肌钙蛋白结合引起收缩;复极时,肌浆网上的钙泵(Sarcoendoplasmicreticulum Ca2+-ATPase, SERCA2)在受磷蛋白(Phospholamban, PLB)的调节下,将胞浆中的钙离子重新摄入肌浆网中进行贮存;从而使[Ca2+]i 降低,细胞舒张,且保持细胞内外钙离子浓度的稳定,有利于下一个收缩周期的进行.因此SERCA、PLB 及SERCA/PLB 的异常则影响着钙离子在细胞内的稳定是心衰发展的重要机制.
据《本草纲目》记载,黄芪为补药之长,有补气升阳、固表止汗、利水消肿、托毒生肌等功效,是中医治疗心气虚证的益气温阳药的典型代表.其治疗心衰的机制与改善心脏泵血功能、干预心室重塑和调节神经内分泌系统等有关,研究表明黄芪皂苷Ⅳ能够调节急性心衰大鼠肌浆网上SERCA 的mRNA 以及蛋白水平的表达,并通过增加PLB 的磷酸化水平来提高SERCA 的活性以促进其对Ca2+摄取[1].丹参作为中国传统中药,最早见于《神农本草经》,被列为上品.在临床上广为应用,尤以治疗冠心病及缺血性脑血管病最为常用.但是从肌浆网钙转运蛋白角度对其研究较少,本研究通过观察AngⅡ诱导心肌细胞肥大模型SERCA 和PLB mRNA 的转录水平以及黄芪注射液、丹参注射对其影响,对黄芪注射液,丹参注射液改善心衰的可能作用机理进行探讨.
1 材料和方法
1.1 实验动物
1~3 天Wistar 乳鼠(由中国医学科学院实验动物中心提供,许可证编号:01010104.)
1.2 主要试剂和仪器
血管紧张素Ⅱ(Sigma Inc);注射用丹参(冻干)(哈药集团中药二厂,批号:071125);黄芪注射液(成都地奥九泓制药厂,批号:0410027);胰蛋白酶(Sigma Inc);Ⅱ型胶原酶(Gibco Inc);DMEM/F-12(Sigma Inc);特级胎牛血清(Hyclone Inc);Hepes(RocheInc);5-溴脱氧尿嘧啶(Sigma Inc);10×RNA Loading Buffer(promega Inc);RNasein(promega Inc);2×Taq PCR MasterMix(promega Inc);M-MLV(promega Inc);Oligo(dT)(promega Inc);2323 型CO2 培养箱(SHEL-LAB);CLASS 100 型超净台(再鑫);IX71型制冷摄像头倒置荧光显微镜(Olympus);倒置相差显微镜,成像及分析系统(Olympus);水平电泳仪(BIO-BAD Inc);PCR 仪(Eppendorf);凝胶成像系统Flour Chem(Alpha Innotech)
1.3 心肌细胞培养
参照文献采用改良Harary 法获得细胞.取出心室用D-Hank′s 清洗后将心肌组织剪成约1mm3 大小的泥状.用配好的胰蛋白酶及胶原酶Ⅱ混合物将其消化分离成单细胞悬液,加入10%FBS-DMEM/F12 终止消化,滤去组织渣后按差速贴壁分离法37℃,5%CO2 孵育1.5h.轻轻收集尚未贴壁的细胞悬液,细胞计数,依需要密度接种在6 孔培养板中.培养液中加入1%Brdu 和1‰青、链霉素.置于37℃,5%CO2 培养.24h 换液,72h 后换成不含有Brdu的1%FBS-DMEM/F12 培养基.
经上述方法分离制备的心肌细胞,通过肌动蛋白免疫组化染色,其纯度可以达到95%以上.
1.4 肥大心肌细胞模型的建立及实验分组
采用血管紧张素Ⅱ刺激法,将正常的细胞培养液换成含1%胎牛血清的DMEM/F12 培养液培养1 天后,加入浓度为10-7mol/L 的血管紧张素Ⅱ,于37℃、5%CO2、95%湿度环境培养,大约每36~48 小时换一次液,培养3~4 天后即可诱导心肌细胞肥大.将分离纯化的心肌细胞分为对照组;模型组(终浓度AngⅡ10-7molL-1);丹参注射液组(终浓度10-7molL-1AngⅡ+10-6molL-1 丹参注射液);黄芪注射液组(终浓度为10-7molL-1 AngⅡ+10-6gL-1黄芪注射液);联合用药组(终浓度为10-7molL-1 AngⅡ+10-6gL-1 黄芪注射液+10-6molL-1丹参注射液).
1.5 SERCA、PLB 基因转录水平的测定
1.5.1 总 RNA 的提取
采用 TRIzol 法提取心肌组织总RNA,取2×106 细胞,加入TRIzol Reagent 400μl 反复吹打,室温静置5min,加入氯仿80μl,室温静置3min,12000r/min 离心15min;取水相加入等体积的异丙醇,-20℃静置30min,12000r/min 离心15min;弃上清,加入75%乙醇400μl 洗涤沉淀,7500r/min 离心5min;弃上清,在超净台室温干燥,加入DEPC 水溶解沉淀.用紫外分光光度计检测纯度和含量,琼脂糖凝胶电泳分析其完整性.
1.5.2 引物合成
内参基因β-actin 及基因SERCA 及PLB 引物,均由北京赛百盛基因公司合成.β-actin上游:5′-CCAACCGTGAGAAGATGACA-3′,下游:5′-TCGCCAGAATCCAGAACAAT-3′,扩增产物长度为130bp.SERCA 上游:5′-TCTGACTTTCGTTGGCTGTG-3′,下游:5′ -GCCTTTGTTATCCCCAGTGA-3 ′ , 扩增产物长度为121bp .PLB 上游: 5 ′-CTTTTGTCTTCCTGGCATCA-3′,下游5′-AGGTTCTGGAGGTTCTGACG-3′,扩增产物长度为111bp.
1.5.3 两步法 RT-PCR
RNA 的反转录体系:反应体系:RNA 1μl,Oligo(dT) 1μl,dNTP 1μl,5×Buffer 5μl,RNasin 0.5μl,M-MLV 逆转录酶 1μl,DEPC-H2O 10.5μl.混合以上反应物,离心,涡旋,再次离心后装入PCR 小管,总体积25μl.反应条件:42℃反应60min,95℃反应5min.PCR 反应:反应体系:cDNA 2μl,Sense Primer 1μl,Antisense Primer 1μl,2×Taq PCRMasterMix 12.5μl,ddH2O 8.5μl.混合以上反应物,离心,涡旋,再次离心后装入PCR 小管,总体积25μl,放入PCR 仪.扩增条件均为:95℃预变性5min,之后94℃ 30s,55℃ 30s,72℃ 30s,扩增35 个循环,72℃ 8min.
1.5.4 电泳及图像分析
2%琼脂糖凝胶,电压100V 电泳1.0 小时.对电泳之后的琼脂糖凝胶用ImageMaster VDS凝胶图像分析系统进行数码图像摄取,以在组织中表达稳定的β-actin 条带作为内参照,用目的基因的光密度与内参照条带的光密度的比值为半定量分析数据.
1.6 统计学处理
数据以均数±标准差( x ±S)表示.运用SPSS17.0 软件,采用单因素方差分析(ANOVA)进行统计处理,组间比较采用LSD-t 检验,以P<0.05 作为差异存在统计学意义的界限.
2 结果
2.1 黄芪、丹参对肥大心肌细胞各时点SERCA2a mRNA 转录水平的影响
根据可以看出,模型组SERCA2a mRNA 转录水平在造模后48h 及72h 明显低于正常组(P<0.01),各给药组治疗均可不同程度的上调SERCA2a mRNA 表达,其中丹参注射液主要作用在给药后48h 及72h(P<0.01),黄芪注射液给药后各个时点均与模型组有显着差异(P<0.01),联合用药组在给药后72h 效果显着(P<0.01)(电泳图谱1- A、B、C).
2.2 黄芪、丹参对肥大心肌细胞各时点PLB mRNA 转录水平的影响
从结果来看,模型组PLB mRNA 转录水平在造模后72h 明显下降(P<0.01),丹参注射液组给药后72h 可使PLB mRNA 表达上调(P<0.01),黄芪注射液及联合用药组疗效不显着(电泳图谱2- A、B、C).
2.3 黄芪、丹参配伍对肥大心肌细胞各时点SERCA2a/PLB 的影响
造模后 48hSERCA2a/PLB 比值明显降低,与正常组相比有显着性差异(P<0.01),各给药组均能升高SERCA2a/PLB 比值,丹参注射液主要作用在给药后48h(P<0.01),黄芪注射液及联合用药组则在给药后各个时点与模型组比较均有显着性差异(P<0.01).
3 讨论
Ca2+是体内最重要的第二信使,心肌肌浆网Ca2+-ATP 酶(sarco/endoplasmic reticulumCa2+-ATPase, SERCA)在心肌Ca2+调节中发挥重要的作用.心肌细胞中SERCA 的主要亚型是SERCA2a,其数量和活性影响了心肌细胞对钙的调节及心肌细胞的舒缩功能.正常情况下,舒张期Ca2+从肌钙蛋白上解离,SERCA2a 将大部分(70%)Ca2+回摄至肌浆网内储存.此过程通过受磷蛋白(phospholamban, PLB)对其活性起调节作用;PLB 去磷酸化时与SERCA2a 结合,抑制了SERCA2a 对Ca2+的亲和力,而PLB 磷酸化后与SERCA2a 解离,SERCA2a 对Ca2+的亲和力增加.SERCA2/PLB 的比率增高,SERCA 对Ca2+的转运活力增强,反之,则减弱.SERCA 的活性是由受磷蛋白来进行可逆性调节的.PLB 是结合在心肌细胞肌浆网上的磷酸蛋白,其作用是与SERCA 作用后抑制SERCA 对Ca2+的摄取功能,PLB被磷酸化后对SERCA 的抑制作用消失,使SERCA 与Ca2+亲和力增加,肌浆网Ca2+摄取速度显着增加[2],目前认为这一机制是心肌舒缩的主要动态调节方式.
目前多数动物实验研究发现左室肥厚时SERCA2a mRNA 水平下降[3-6],也有研究发现SERCA2a mRNA 在心肌肥厚时无显着改变[7、8].而Arai 等[9]报道 SER2CA2a mRNA 在大鼠心肌轻度肥大时表达上调 ,在中重度肥大时表达下调.表明从心肌代偿性肥厚到衰竭的过程,肌浆网基因表达发生了量的改变,最终导致肌浆网功能障碍.大量实验显示在心衰的心肌细胞中,SERCA2a 活性明显下降,同时伴有Ca2+摄取减少,胞质内Ca2+聚集,影响心脏的舒张功能[10].在慢性心力衰竭中,心肌细胞SERCA2a 的表达降低,功能下降,SERCA2a/PLB 的比例下调.
PLB 受环磷酸腺苷磷酸化调节,当其磷酸化后便解除对肌浆网 Ca2+-ATPase 抑制,促进钙泵逆浓度梯度摄取 Ca2+.目前对 PLB 在心肌肥厚中的研究较少 ,有报道其 mRNA 水平下降的[4,6]也有报道不变的[9].对人肥厚心肌研究发现PLB mRNA 水平显着下降.SERCA/PLB 提示了SERCA2a 受抑制程度,其比例正常与否是评价心肌舒缩功能的重要指标.因此通过药物维持SERCA、PLB 及SERCA/PLB 在合适的水平,理论上可以阻止心衰的发生发展.
根据前期实验结果提示给予AngⅡ后24h 细胞进入心肌肥大稳定代偿期;48h 之后心肌细胞开始进入衰竭期;至72h 心肌细胞完全进入心衰失代偿期.本实验以此来模拟心肌细胞从肥大走向心衰的全过程.在给予AngⅡ后24h,SERCA2a 和PLB mRNA 水平与正常组相比已经开始下降,SERCA2a /PLB 比例亦成下降趋势,但没有统计学意义.48h,SERCA2a 和SERCA2a /PLB 比例显着下降,PLB mRNA 水平下降不明显.72h,PLB mRNA 水平显着下降,SERCA2amRNA 水平,SERCA2a /PLB 比例仍呈下降趋势,心肌细胞进入完全失代偿期.在现有的研究中均提示在心肌肥厚走向心衰的过程中SERCA2a 和PLB mRNA 水平受损,呈平行下降,SERCA2a /PLB 比例作为评价肌浆网回摄Ca2+能力的重要指标在心肌肥厚初期即可提示肌浆网功能受损.
丹参注射液、黄芪注射液及其联合用药可在心衰的不同时期对使给予AngⅡ的心肌细胞PLB mRNA 水平升高、并上调SERCA2a 的mRNA 转录水平改善SERCA/PLB 比例,提示丹参注射液,黄芪注射液治疗心肌肥厚、心衰的部分机理可能是通过恢复SERCA2a、PLBmRNA 转录水平,改善心肌细胞内钙循环,从而改善心肌收缩舒张功能的.同时其联合用药优势体现在心衰期,提示在心肌肥厚的不同时期,正确选择用药可以起到保护肌浆网钙摄取相关蛋白mRNA 的稳定,从而保证肌浆网钙摄取能力.
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